În timpul când Sfântul Apostol Pavel a fost pentru prima oară în Listra, Timotei era un copil și neputând să călătorească, Sfântul Apostol Pavel l-a lăsat acasă în grija unor dascăli iscusiți. Dar după câțiva ani, pornind Sfântul Pavel în călătoria a II-a apostolică, adică între ani 49-54, însoțit de Sila, a venit din nou în Listra și l-a luat și pe Timotei cu el la apostolie.

Din Listra au trecut în Macedonia (anul 52). Au propovăduit în Filipi, în Tesalonic și Bereea. Timotei a rămas aici ca să întărească pe credincioși în sfânta învățătură. După aceea a fost trimis de Sfântul Pavel la Tesalonic să mângâie și să încurajeze pe cei de acolo. Ceva mai târziu s-a întâlnit cu dascălul său în Corint și s-au dus la Ierusalim, apoi la Efesunde au stat mai bine de doi ani.

Cum creștinii din Corint aveau nevoie de ajutor în păstrarea credinței, Timotei a fost trimis la ei. Întâlnindu-se iarăși în Troada, s-au întors în Palestina. De data aceasta, Sfântul Apostol Pavel a fost prins în Cezareea și trimis la Roma. Timotei l-a însoțit și la Roma. După ce Sfântul Ioan Evanghelistul, primul Episcop al Efesului, a fost alungat de împăratul Domitian în insula Patmos, Sfântul Timotei a devenit episcopul Efesului.

La data de 22 ianuarie 97 păgânii din Efes l-au ucis pe Sfântul Apostol Timotei cu pietre, primind astfel cununa muceniciei. În anul 356, sfintele lui moaște au fost duse în Constantinopol de Sfântul Artemie Duxul, din porunca împăratului Constantin, și au fost puse în Biserica „Sfinților Apostoli”, împreună cu ale Sfinților Luca și Andrei.